Cuenca Rural

Miércoles 10.03.2010 Resumen

En broiler Hubbard machos de 1 a 49 días de edad, con y sin ayuno, se determinó la concentración de triglicéridos de la fracción lipoproteica VLDL+LDL, precipitada selectivámente con po­lianiones, por una adaptación del método químico colorimétrico comercial de uso humano. Se obtuvo concentraciones de triglicéridos menores en aves con ayuno de 12 horas, que en aves sin ayuno previo a la extracción de la muestra de sangre. También se estimó los triglicéridos de la fracción VLDL por un método rápido de turbidez, obteniéndose una corre­lación significativa entre ambos.

Palabras claves: triglicéridos, broiler.

Introducción

Las lipoproteínas son la forma de transporte de los lípidos en la sangre tanto en los mamíferos como en las aves. Por técnicas inmunológicas (doble difu­sión) se han determinado distintas fracciones de lipoproteínas en plasma de gallinas en postura que son: de muy baja densidad (VLDL) y baja densidad (LDL), de alta densidad (HDL) y lipovitelina (LV). Esta última no está presente en el macho adulto. En el caso de los pollos de asar o broiler, las fracciones identificadas inmunológicamente son un complejo VLDL+LDL y HDL. Adicionalmente, por ultra­centrifugación, se ha separado el componente VLDL del LDL (Yu y col., 1976).

El componente lipídico de las lipoproteínas com­prende principalmente fosfolípidos, colesterol y tri­glicéridos, que se distribuyen en distinta concentra­ción en las fracciones. Es así como los principales constituyentes de la fracción VLDL en aves hem­bras no en postura, machos y pollos broiler son los triglicéridos (Yu y col., 1976; Chapman, 1980), los cuales, son de origen intestinal (portomicrones o quilomicrones) y hepático. En pollos broiler, la fracción LDL contiene igual concentración de tri­glicéridos y fosfolípidos y la fracción HDL presenta abundante proporción de fosfolípidos y colesterol y menor de triglicéridos (Yu y col., 1976).

En los broiler, la concentración de triglicéridos plasmáticos totales, como de las fracciones lipopro­teicas está influenciada por el tipo de alimentación y el consumo de alimento, observándose bajas con­centraciones en aves postayuno de 12 horas (Griffin y col., 1982).

Con el objeto de establecer programa de selec­ción de líneas genéticas de pollos broiler de carcasa magra, se ha propuesto estimar el contenido de grasa corporal de estas aves en base a la determina­ción de los triglicéridos; ya que se ha demostrado una correlación significativa entre el contenido gra­so de la carcasa y la concentración de triglicéridos de la fracción VLDL+LDL, relación que es menor con los triglicéridos plasmáticos totales (Whitehead y Griffin, 1982; Whitehead y col., 1984). Sin em­bargo, lo anterior requiere de la separación de las fracciones lipoproteínas por métodos que no son de rutina en laboratorios de diagnóstico veterinario, como la ultracentrifugación y la electroforesis de lipoproteínas, lo que hace que esta metodología sea poco aplicable a programas prácticos de manejo alimentario y selección a gran escala.

Como una alternativa a lo anterior, se ha recurri­do a la separación de la fracción VLDL+LDL por precipitación selectiva con polianones, de acuerdo al método de uso humano de Burstein y col. (1970) y a la determinación de los triglicéridos en ella por técnicas fluorométricas automatizadas (Noble y Campbell, 1970; Griffin y col., 1982) las cuales no se encuentran disponibles en laboratorios clínicos de rutina. También se ha reportado un método rápi­do de turbidez, específico para la determinación de la fracción VLDL+LDL en broiler, cuyo principal componente son los triglicéridos, para estimar el contenido de grasa corporal (Griffin y Whitehead, 1982); el cual además ha sido utilizado posterior­mente en pavos (Bacón, 1985) y en codornices (Garwood, 1987).

En la actualidad, existen métodos químicos co­mérciales para la determinación de triglicéridos en humanos, como los enzimáticos colorimétricos, los cuales pueden ser usados en animales domésticos, siempre y cuando se conozcan las concentraciones de la especie en estudio para acceder al rango de la curva estándar humana.

En esta comunicación preliminar se presenta la determinación de los triglicéridos de la fracción lipoproteica VLDL+LDL en pollos broiler machos por la adaptación de un método químico colorimé­trico de uso humano y por la prueba rápida de turbidez, con el objeto de contar con una tecnología aplicable a la infraestructura de nuestro laboratorio y utilizarla en investigaciones nutricionales y gené­ticas de pollos broiler.

Material y método

Se trabajó con 153 pollos broiler Hubbard machos de 1 a 49 días de edad, mantenidos en baterías de crianza entre los días 1 a 28 y de recría entre los 28 a 49, con un régimen de luz de 10 horas diarias. Los pollos fueron alimentados con raciones balanceadas de acuerdo a la edad recibiendo alimentación y agua a voluntad. Se tomó muestras de sangre de aves de distintas edades, considerando 2 grupos: sin ayuno (72 aves) y con ayuno de 12 horas previo a la extracción (81 aves), con el objeto de contar con muestras de distintas concentraciones de triglicéri­dos. La sangre se obtuvo por punción cardíaca en tubos que contenían una solución de EDTA al 5% en NaCI 0,15 M, usado en concentración de 2 mg/ml, obteniéndose el plasma por centrifugación a 1.000 g por 10 min y procesándolo inmediatamen­te después de obtenido.

En el método químico colorimétrico propuesto, primero se realizó la separación de la fracción lipo­proteica VLDL+LDL del plasma, por precipita­ción selectiva, utilizando dextrán sulfato (PM 500.000) 0,032 mmol/L en cloruro de magnesio 1,5 mmol/L, Wiener1. Se tomó 100 µl de plasma y 10 µl de dextrán sulfato, luego de 30 min en refrigera­ción, las muestras se centrifugaron a 1.000 g por 5 min, trabajándose con el precipitado, en el que se determinó el contenido de triglicéridos por el méto­do enzimático colorimétrico GPO-PAP, Merck2 , efectuando las lecturas a 540 nm y expresando los resultados en mg/dl. Se utilizó como control Sero­norm, Merck2.

El método de turbidez que precipita la fracción VLDL se realizó de acuerdo a lo descrito por Griffin y Whitehead (1982), con algunas modificaciones donde 0,4 ml de plasma se mezclaron con 4 ml de una solución de 0,25 g Heparina/litro de Mg CI2 0,15 M, NaCI 0,154 M, Tris 10 mM y HCI a pH 7,4. Luego de 30 min a temperatura ambiente se leyó la turbidez producida como la absorbancia a 540 mm, expresándose los resultados como unida­des de absorbancia. Se utilizó el doble de volumen de plasma señalado por el método original.

Se realizó un análisis de varianza con los resulta­dos de la concentración de triglicéridos obtenidos por el método químico colorimétrico en los grupos de aves con y sin ayuno, como también un estudio de correlación entre el método químico colorimétri­co y el de turbidez.

Resultado y discusión

El adipocito de pollo tiene una limitada capacidad para sintetizar ácidos grasos de novo (Fisher, 1984) y la mayor proporción de la grasa que existe en el tejido adiposo, deriva de los triglicéridos plasmáti­cos de origen hepático, los cuales se transportan principalmente como lipoproteínas VLDL y LDL (Griffin y col., 1982). No obstante, sólo los trigli­céridos presentes en la fracción VLDL estarían dis­ponibles para la síntesis de estos ácidos grasos, existiendo una correlación significativa entre su concentración y el grado de engrasamiento corporal (Griffin y Whitehead, 1982).

Este hecho constituye la base de la utilización de la concentración de triglicéridos de las fracciones lipoproteínas, como medida indirecta de selección de broiler magros u obesos (Griffin y col., 1982; Whitehead y col., 1986; Grunder y col., 1987), como también, de su aplicación a estudios metabó­licos nutricionales. De lo anterior se deriva la im­portancia de contar con técnicas analíticas simples y adecuadas, pero de acuerdo a las disponibilidades de equipo de los laboratorios de diagnóstico veteri­nario nacionales.

El método comercial químico colorimétrico de uso humano que fue utilizado para la determinación de los triglicéridos de la fracción VLDL+LDL en los broiler, tiene un rango de sensibilidad de hasta 1.000 mg/dl, de modo tal que su aplicación es válida para la determinación de los triglicéridos en aves con y sin ayuno. Sin embargo, el procesar un gran número de muestras por este método, es costo­so y requiere de mucho tiempo por lo que no sería aplicable a programas prácticos de selección y de manejo nutricionales.

En el presente estudio, al comparar los triglicéridos de la fracción VLDL+LDL determinados por este método en aves con y sin ayuno, se confirmó que las aves ayunadas presentan, a pesar de la variabilidad indi­vidual, concentraciones significativamente inferio­res (p < 0,001) que las sin ayuno, con valores promedios de 22,2 ± 15,2 y 68,5 ± 37,5 mg/dl, respectivamente.

El efecto del ayuno sobre la con­centración de triglicéridos de la fracción VLDL+LDL obtenida en este trabajo, concuerda con lo observado por Nir y col. (1974), en aves machos New Hampshire y White Leghorn; por Griffin y col. (1982) en broiler y Bacon (1985), en pavos machos, en relación con que el ayuno y la restricción alimenticia disminuyen la concentración de triglicéridos plasmáticos totales y de las distintas fracciones lipoproteicas.

En el método de turbidez de Griffin y Whitehead (1982), la precipitación de las lipoproteínas, se basa en la interacción de soluciones de Heparina y Mg C12 con la apolipoproteína β común a VLDL y LDL y ausente en las otras fracciones lipoproteicas. De acuerdo a la concentración de Mg Cl2 utilizada, se precipita selectivamente VLDL + LDL o sólo VLDL.

Es un método rápido e indirecto de estima­ción de la concentración de triglicéridos de dichas fracciones, especialmente de VLDL, cuyo.princi­pal componente son triglicéridos al aplicar este método en aves en ayuno, se obtuvo bajas lecturas de absorbancia, situación que podría inducir a error de lectura en espectrofotómetros corrientes. Para evitar este problema se trabajó en todas las mues­tras, aumentando al doble el volumen de plasma en relación a lo que señala el método original.

En las figuras 1 y 2 se presenta la relación entre el método químico (precipitación y colorimetría) y el de turbidez (precipitación) en la estimación de los triglicéridos de las fracciones lipoproteicas, obte­niéndose un coeficiente de correlación (r) de 0,72, para las aves en ayuno y de 0,74 en las sin ayuno, ambos estadísticamente significativos (p 0,01). Debe destacarse adicionalmente que el coeficiente de regresión entre ambos métodos fue similar (b = 0,0034 y 0,0033 para aves con y sin ayuno, respec­tivamente). Estos datos son concordantes a lo seña­lado anteriormente por Griffin y Whitehead (1982), quienes usaron técnicas fluorométricas automatiza­das para la determinación de los triglicéridos.

Figura 1. Relación entre el método químico colorimétrico (X) y el de turbidez (Y) en la estimición de los triglicéridos de las lipoproteínas plasmásticas de muy baja (VLDL) y baja densidad (LDL) en broiler ayunados.

Figura 2. Relación con el método químico colorimétrico (X) y el de turbidez (Y) en la estimación de los triglicéridos de las lipoproteínas plasmáticas de muy baja (VLDL) y baja densidad (LDL) en broiler sin ayuno.

De acuerdo a los resultados de esta comunica­ción preliminar, es posible determinar los triglicéri­dos de las fracciones lipoproteicas de las aves, adaptando métodos químicos colorimétricos co­merciales de uso humano, cuando no se dispone de ultracentrífugas o equipos automatizados. Por otra parte, se demuestra la adecuación de métodos de turbidez para la estimación indirecta de los triglicé­ridos de la fracción VLDL, dada su correlación con el método químico colorimétrico. La técnica de turbidez, por sus características y bajo costo, per­mite la aplicación de bioquímica clínica en investi­gaciones nutricionales y genéticas de aplicación práctica como es la producción y selección de po­llos broiler de baja adiposidad, condición que debe ser buscada por la industria avícola nacional.

 

Segovia C., Paula (TM); Villouta C., Gladys (MV); Cornejo V., Sergio (MV, MS); López V., Alejandro (MV, MS); Pokniak R. José (MV, MS)
Departamento de Patología Animal y de Fomento de la Producción Animal. Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuaria, Universidad de Chile
Determinación de triglicéridos en fracciones lipoproteicas de pollos broiler por métodos químico colorimétrico y de turbidez. Avances en Medicina Veterinaria, Vol.5(1)