Cuenca Rural

Jueves 21.08.2008Los programas de control de la mamitis ovina y caprina se aplican masivamente en toda España. El interés por las mamitis se manifiesta en la realización de miles de análisis microbiológicos que permiten al veterinario conocer la etiología de estos problemas y proponer las medidas de control más adecuadas.

Con estos datos, hemos analizado la distribución mensual de los diferentes agentes etiológicos encontrados en los análisis. En las siguientes tablas y figuras presentamos los resultados obtenidos con el estudio de 3.280 casos diferentes.

Material y métodos

En el laboratorio se han recibido 3.280 envíos (casos) repartidos entre ovejas (2.666 casos) y cabras (614 casos) y procedentes de toda España. Las muestras pertenecen a un periodo que va de Enero de 1996 a Diciembre de 2000. En cada uno de los casos estudiados el veterinario remitente envió de 3 a 20 muestras de leche incluyendo, en muchas ocasiones, una muestra del tanque.

Cada caso se ha considerado como positivo si en alguna de las muestras recibidas se ha identificado el patógeno estudiado. En todos los casos las muestras corresponden a animales positivos al test de California. Por el objetivo del trabajo no se han separado las muestras que pertenecían a mamitis clínicas de las subclínicas.

Cultivo microbiológico

Cada leche individualizada se sembró en agar sangre y agar MacConkey (Oxoid) y se incubó aeróbicamente a 37ºC durante 72 h. Las bacterias aisladas fueron identificadas siguiendo protocolos estándar (Carter y Cole, 1990).

Todas las muestras de leche recibidas fueron sembradas en el medio Friis and Modified Hayflicks's para Mycoplasmas suplementado con Acetato de Thalio 200 µg/ml, Penicilina 100 UI/ml, Suero de caballo (10% v/v) y Suero de porcino (10% v/v). En todos los casos y para maximizar la recuperación de los Mycoplasmas las muestras se preincubaron en caldo durante 3-7 días para luego ser incubadas en agar durante un período de hasta 15 días y a 37ºC. Las colonias sospechosas fueron subcultivadas y conservadas en congelación.

Detección de antígenos de Mycoplasma por Inmunoperoxidasa indirecta

De las muestras de leche recibidas de cada explotación se hizo un pool de 6-10 leches, o directamente se trabajo con la muestra de tanque. Las células de la leche se recogieron mediante centrifugación en tubos eppendorf de 1,5 ml, donde se centrifugaron a 1000 x g durante 5 minutos, y se lavaron 3 veces con PBS.

La población celular separada se ajustó en cada caso a una concentración de 5-6 x 105 células/ml utilizando una cámara de Newbaver y 10 µl de las suspensiones celulares se depositaron sobre portaobjetos multiesferas. Las células se fijaron durante 30 min, en una solución de acetona al 20% en PBS 0,01M, pH 7,2 conteniendo 0,1% de Tween 80, y 0,05% Cas-block, (Zymed, 008020).

Los inhibidores inespecíficos y la peroxidasa endógena se minimizaron con una postfijación durante 10 min. en peróxido de Hidrógeno al 0,3 %. Tras una serie de lavados en PBS-Tween, se aplicaron 10 µl de la dilución de anticuerpos primarios por muestra durante 1 h en cámara húmeda a 37 ºC.

Como control negativo de la prueba se utilizó suero de conejo libre de Mycoplasma (Sigma S-3509) o diluyente de anticuerpos (PBS 0,01 M pH 7,2). Los segundos anticuerpos conjugados con peroxidasa, se aplicaron a las muestras problema y a los controles, con los mismos parámetros de incubación que los primeros.

Los inmunocomplejos resultantes se revelaron con 9 amino-3 ethyl carbazole (AEC, Sigma A-6926) en Dimethylformamide (DMF, Sigma D-4254), y buffer acetato 50 mM pH 5, aplicado durante 10 min a temperatura ambiente y en oscuridad. La reacción se detuvo con agua destilada para aplicar una tinción de contraste con Hematoxilina de Mayer (Zymed 00-8001). Las láminas, montadas con GVA (Zymed 00-8000), se estudiaron en microscopía de campo claro a 1000 aumentos.

Los anticuerpos primarios empleados fueron: Mycoplasma agalactiae, capricolum, capripneumoniae, mycoides y putrefaciens y procedían del Public Health Laboratory service. National Collection of Type Cultures. PHSL. 61 Colindale avenue, London NW9 5HT. Como segundo anticuerpo se empleo un monoclonal anti IgG de conejo conjugados con peroxidasa (Sigma A-9452, Mab clone GT-34).

En las leches procedentes de ganado ovino normalmente se utilizó sólo un anticuerpo frente a M. agalactiae, mientras que en las muestras que procedían de caprino se utilizó un pool de los 5 anticuerpos.

Resultados

En la Tabla 1 podemos encontrar el número y porcentaje de aislamientos de los distintos patógenos y el número de envíos totales.

Tabla 1: Muestras recibidas y aislamientos de los casos estudiados durante los 5 años.

	Ovejas		Cabras
Muestras recibidas	2666		614
Staphylococcus aureus	804	30%	74	12%
Staphylococcus coagulada negativo (SCN)	1424	53%	222	36%
Mycoplasma spp.	868	33 %	338	55%
Streptococcus agalactiae	210	8%	13	2%

Casos recibidos

En la Figura 1 se observa la evolución del porcentaje de casos recibidos en el laboratorio mes a mes con respecto al número de casos recibidos cada año. Se observan diferencias significativas (P<0,001) entre meses, que se explican fácilmente por la estacionalidad en la producción lechera del ovino y caprino.

Figura 1: Evolución del porcentaje de casos recibidos en el laboratorio en ese mes con respecto al número de casos recibidos ese año. Se representa el promedio de los 5 años con su desviación estándar.

En ganado ovino observamos que la frecuencia con la que se aisló S. aureus en alguna de las muestras es significativamente (p<0,05) mayor en primavera (Febrero-Abril) que en el resto de los meses. Este efecto no se observó en ganado Caprino.

Figura 2. En ganado ovino observamos que la frecuencia con la que se aisló S. aureus en alguna de las muestras es significativamente (p<0,05) mayor en primavera (Febrero-Abril) que en el resto de los meses. Este efecto no se observó en ganado Caprino.

 

Staphylococcus coagulasa negativo (incluido S. epidermidis), S. agalactiae y Mycoplasma spp.

En este caso no se observaron diferencias significativas en la frecuencia en que los diferentes patógenos aparecen mes a mes. Así, la frecuencia esperada en cada caso la encontramos en la Tabla 1.

Discusión

Hay una escasez de artículos con resultados negativos porque normalmente son poco atractivos para las revistas científicas. Sin embargo, en la opinión de muchos investigadores los resultados negativos, aunque pobres en algunos aspectos, sí aportan muchos datos interesantes.

En este trabajo ponemos en evidencia la ausencia de estacionalidad en la etiología de las mamitis ovinas y caprinas, es decir, que ningún patógeno (excepto S. aureus en ovino) aparece más (cualitativamente) en una época del año que en otra. En nuestro conocimiento es la primera descripción en que se sugiere la posible estacionalidad de las mamitis producidas por S. aureus en ovino.

Por otro lado, el mes del año sí tiene un efecto en el Recuento de Células Somáticas de las explotaciones de ovino y caprino. De hecho el RCS aumenta en los meses de Verano y Otoño y disminuye en Invierno y Primavera (Gonzalo C y otros, OVIS, Mayo 1998, 56, pags 38-39), sin embargo este efecto se asocia a la menor o mayor producción láctea en esos meses y no a un incremento en las mamitis.

Exopol