Cuenca Rural

Jueves 11.03.2010Resumen 

En el presente trabajo se probaron dos concentraciones de pentoxifilina (10 mM y 6 mM) y dos de cafeína (10 mM y 6 mM), adicionadas a un medio de cultivo definido de amplio uso en fertilización in vitro (FIV), TCM 199.

Se trabajó con un "pool" de pastillas de semen pertenecientes a 6 toros diferentes, descongelándose dos pastillas por repetición, realizándose 5 repeticiones. El semen reconstituido se colocó en baño a 37°C, observándose a distintos tiempos postdescongelamiento (0', 15' , 30', 60', 120' y 180'). Se determinó el porcentaje de células mótiles y el vigor de las mismas, en una escala de 5 puntos.

El análisis estadístico se realizó mediante una ANDEVA para un diseño completamente al azar y posteriormente se efectuó un test de Duncan.

Los resultados obtenidos indican que a partir de los 30' existirían diferencias significativas para motilidad entre los tratamientos con pentoxifilina y con 10 mM de cafeína respecto al testigo y al de 6 mM de cafeína. Similar respuesta se observa en el caso del vigor a partir de los 120'. Los tratamientos con diferentes concentraciones de cafeína arrojaron diferencias significativas entre ellos, no así las distintas concentraciones de pentoxifilina.

Puede concluirse que el agregado de 6 mM de pentoxifilina o 10 mM de cafeína permitirían prolongar en el tiempo la viabilidad del semen congelado posteriormente a su reconstitución, resultando esto de interés para su utilización en FIV.

Palabras clave: semen bovino, criopreservación, pentoxifilina, cafeína, hiperactividad.

Introducción

Es ampliamente conocido el efecto estimulatorio de las metylxantinas sobre la motilidad y el vigor de los espermatozoides frescos (Garbers y col., 1971 a), aunque 6 mM de cafeína producen efectos positivos sobre el incremento de la motilidad del semen bovino fresco (datos no publicados), esta concentración no resultó efectiva para el semen congelado de la misma especie (Wilde y col., 1989/90) (Wilde y col., 1996).

El uso de semen congelado en fertilización in vitro (FIV) es una práctica muy difundida en producción animal, el mismo se maneja habitualmente en medios de cultivo enriquecidos que permiten mantener su viabilidad por tiempos relativamente prolongados.

Resultaría de importancia para trabajos de FIV contar con sustancias que produzcan un real efecto estimulatorio sobre espermatozoides criopreservados, dado que una buena y prolongada motilidad permitiría realizar con mayores probabilidades de éxito los trabajos previos de acondicionamiento del semen para la fertilización.

A fin de determinar si es posible obtener un comportamiento similar al observado en semen fresco, alcanzando niveles significativos de hipercinesis, se utilizaron concentraciones mayores de cafeína y se probó un nuevo agente perteneciente a las metylxantinas, la pentoxifilina.

Materiales y métodos

Se empleó semen congelado en pellets, proveniente de seis toros de la raza Criolla Argentina, constituyéndose un "pool" de pastillas. De éste se extrajeron dos para cada repetición diluyéndose en 2 ml del medio, a fin de minimizar los efectos derivados de toros y pastillas. De este preparado se tomó una alícuota de 1 ml y se rediluyó en 3 ml del mismo medio para lograr una dilución tal que permita una óptima visualización al microscopio óptico.

Se llevaron a cabo cinco tratamientos, utilizando un medio de cultivo definido (TCM 199) (Tissue Culture Medium, Sigma) con diferentes aditivos. El detalle de los tratamientos es el siguiente:

Tratamiento N° 1: Testigo, sin aditivos.
Tratamiento N° 2: 10 mM de Pentoxifilina (Trental, ICN Biomédicals) C13H18N4O3).
Tratamiento N° 3: 6 mM de Pentoxifilina.
Tratamiento N° 4: 10 mM de Cafeína (1,3,7-trimethylxanthina, Sigma) (C8H10N4O2).
Tratamiento N° 5: 6 mM de Cafeína.

Inmediatamente de disueltas las pastillas se colocaron en baño termorregulado a 37°C en atmósfera de aire, realizándose observaciones a los siguientes tiempos de cultivo postdescongelamiento: 0, 15, 30, 60, 120 y 180 minutos. Se realizaron cinco repeticiones por tiempo dentro de cada tratamiento, totalizando 150 observaciones.

Las mismas fueron realizadas simultáneamente por tres técnicos experimentados, en pantalla de video, grabándose y almacenándose cada repetición debidamente identificada con una clave alfanumérica.

Se midió la motilidad progresiva de los espermatozoides, expresada en porcentaje de células mótiles, y el vigor, relacionado con el tipo de movimiento y expresado en una escala de 5 puntos, detallada en el cuadro N° 1.

Cuadro n° 1: evaluación de semen congelado: vigor (barth a.d. 1990)

El análisis estadístico se realizó con un ANDEVA para un diseño completamente aleatorizado para cada tiempo en estudio, efectuándose posteriormente un test de Duncan para determinar entre cuáles tratamientos se encuentra la diferencia marcada. (se trabajó con el programa SAS).

Los gráficos se confeccionaron con los promedios obtenidos de las cinco repeticiones correspondientes a cada tiempo de observación.

Resultados 

El análisis de la varianza para motilidad y vigor se detallan en los cuadros N° 2 y 3 respectivamente. En los mismos se aprecia que las diferencias comienzan a hacerse significativas a partir de los 30' en el caso de la motilidad y a partir de los 120' en el caso del vigor.

Cuadro Nº 2: análisis de la varianza de la motilidad espermática.

Variable dependiente: MOTILIDAD.
Fuente de variación: TRATAMIENTOS.

Cuadro N° 3: Análisis de la varianza del vigor espermático.

Nota: n.s. (no significado)
* (significativo, al 5%)
** (altamente significativo, al 1%).Variable dependiente: VIGOR.
Fuente de variación: TRATAMIENTOS

En los cuadros 4 y 5 se resumen los valores promedio de motilidad y vigor determinados; con los mismos se confeccionaron los gráficos N° 1 y 2 respectivamente.

Cuadro n° 4: valores promedio de motilidad espermática

Cuadro n 5: valores promedio de vigor espermático

Gráfico Nº 1. Valores promedios de Motilidad espermática en función al tiempo de cultivo.

Grafico Nº 2. Valores promedio de Vigor espermático en función al tiempo de cultivo.

En virtud a los resultados obtenidos con el test de Duncan, se definieron dos grupos de tratamientos:

a) Grupo 1, que agrupa a los de mejor comportamiento, constituido por la pentoxifilina y los 10 mM de cafeína (Tr. 2, 3 y 4).

b) grupo 2, en el que se encuentra el testigo (Tr. 1) y aquel tratamiento que no presentó diferencia con el mismo, 6 mM de cafeína (Tr. 5).

En el Cuadro N° 6 se promediaron los valores de los tratamientos intervinientes en cada grupo de los mencionados, detallándose la variación y la disminución de cada uno de ellos a lo largo del tiempo y la diferencia entre ambos grupos.

Cuadro n° 6: promedios de grupos de tratamientos, variaciones, disminuciones y diferencias

Grupo 1: Tratamientos 2, 3 y 4. * Variación en función al valor obtenido en el minuto 0.
Grupo 2: Tratamientos 1 y 5. **Disminución en función al máximo valor obtenido

Discusión

Las metylxantinas y sus derivados, como la cafeína y la pentoxifilina, producen incremento de la motilidad y el vigor de espermatozoides frescos, razón por la cual son utilizados para el tratamiento de casos de oligozoospermia y astenozoospermia en humanos (Aparicio y col., 1979) (Schill, 1982) (Schoenfeld C. y col., 1975) (Shen y col., 1991).

Esta mayor actividad espermática podría ser causada por el aumento del contenido de AMP cíclico, como consecuencia de la inhibición provocada por las metylxantinas sobre la fosfodiesterasa (Garbers y col., 1971b) (Stefanovich, 1973).

Este efecto estimulante y el mantenimiento del mismo resultan de interés para trabajos de FIV en que se utiliza semen congelado. No obstante, poca o nula estimulación se reportó con bajas concentraciones de cafeína (6 mM) usando semen bovino congelado (Wilde y col., 1989/90 y 1996).

Dosis bajas (6 ó 7 mM) de cafeína son efectivas para semen fresco (Singh y col., 1986) pero demostraron ser ineficientes para semen congelado, ya adicionada previo al congelamiento (Wilde y col., 1996) como al descongelamiento (Wilde y col., 1989/90). Sin embargo, según los presentes resultados, concentraciones mayores (10 mM) permitirían el mantenimiento de altos valores de motilidad y vigor por períodos más prolongados.

Las muestras adicionadas con pentoxifilina se comportaron de manera similar produciendo incremento de la actividad del semen criopreservado, no encontrando en este caso diferencias entre las concentraciones utilizadas.

Experiencias realizadas con concentraciones altas de cafeína no arrojaron diferencias significativas entre 10 y 20 mM agregados al semen fresco, pero determinaron problemas de toxicidad con cantidades mayores. En efecto, con 40 mM la hiperactividad lograda es menos manifiesta y con 80 mM se observa depresión en la motilidad espermática (El-Gaafary y col., 1990).

Al haberse realizado el ANDE VA para cada tiempo de observación en forma independiente, se pudo determinar en qué momento comienza a ser significativa la acción estimulante de los compuestos utilizados.

Motilidad

A partir de los 30' las diferencias comienzan a ser significativas o altamente significativas, lo cual es coincidente con trabajos previos que encontraron diferencias a partir de los 60' (Fuse y col., 1993). Los aspectos más importantes a considerar son los siguientes:

1. El test de Duncan ubica en diferentes grupos a los tratamientos 4 (10 mM de cafeína) y 5 (6 mM de cafeína), lo cual indicaría diferencia significativa entre las distintas concentraciones de este compuesto.

2. En la mayoría de los casos el tratamiento 1 (testigo) también se ubica en grupo diferente a los tratamientos 2, 3 (pentoxifilina) y 4 (10 mM de cafeína).

3. En todos los casos los promedios más bajos corresponden a los tratamientos 1 (testigo) y 5 (6 mM de cafeína).

4. Los tratamientos con distintas concentraciones de pentoxifilina no arrojaron diferencias significativas, por lo que la utilización de 6 mM sería suficiente para provocar efectos estimulantes.

El agrupamiento determinado por el test de Duncan se observa fácilmente en los gráficos, donde se torna manifiesta la constitución de dos grupos definidos; por un lado los tratamientos con pentoxifilina y 10 mM de cafeína, con valores más altos, y por otro el testigo y el de 6 mM de cafeína, con valores más bajos.

Del Cuadro N° 6 se desprende que la pentoxifilina y los 10 mM de cafeína permitirían mantener la motilidad de los espermatozoides en rangos confiables, pera semen congelado utilizado in vitro, hasta 60' más que sin aditivos o con el agregado de 6 mM de cafeína. Resultaría de interés corroborar estos datos in vivo.

Vigor

Las diferencias significativas en este caso se observan a los 120' y 180', ubicándose los tratamientos 1 (testigo) y 5 (6 mM de cafeína) en grupo distinto que los restantes, según el test de Duncan. Se confirmaría de esta manera la superioridad de los tratamientos 2 (10 mM de pentoxifilina), 3 (6 mM de pentoxifilina) y 4 (10 mM de pentoxifilina) sobre los mencionados en primer término.

Los resultados obtenidos permiten concluir que el agregado de pentoxilina (6 ó 10 mM) o de cafeína (10 mM) a medios de cultivo como el TCM 199, prolongarían la viabilidad de los espermatozoides manifestándose una marcada hipercinesis, traducida en aumento de la motilidad y el vigor. Esto permitiría utilizar dichos compuestos en trabajos relacionados con la FIV. Así mismo, la adición de las mencionadas metylxantinas, en las concentraciones estudiadas, a medios de uso habitual en inseminación artificial, prolongaría en el tiempo la viabilidad de los espermatozoides, manteniendo la calidad del semen por períodos más largos y mejorando las perspectivas de éxito de la inseminación.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a la Ing. Zoot., M. Sc., Patricia Chagra Dib por su colaboración para la utilización del Programa Estadístico SAS.

 

De la Vega C. Adolfo, Wilde R. Osvaldo y Cruz L. M*.
* *Facultad de Agronomía y Zootecnia - Universidad Nacional de Tucumán
Efectos de la pentoxifilina y la cafeína sobre la motilidad de espermatozoides bovinos criopreservados, Avances en Ciencias Veterinarias Vol 12 (2)